PCR扩增流程与常见异常排查

适用场景

常规科研DNA片段扩增的操作准备与异常复核。本流程不指定通用反应配方，不同聚合酶按各自说明书执行。[1,2]

模板、引物、适用聚合酶与缓冲体系、无核酸酶水和配套耗材、PCR仪，以及产物检查所需物料。

1. 确认模板身份、引物信息及预期片段长度，检查所用酶与任务是否匹配。

2. 制作加样表，按所用产品说明核算终浓度与反应体积。

3. 在指定配液区域配制公共混合液，再按记录加入样本与对照，减少反复分装造成的差异。[1]

4. 核对热循环程序，运行后按预期片段大小检查产物。

5. 保存原始图像、加样记录及程序，记录异常并逐项复核。

配液区使用专用移液器和合适的防气溶胶吸头，避免既往扩增产物进入反应准备区域。[1,2]

修改条件时明确本轮要验证的因素，并保留未调整条件作为比较依据。

无产物：依次核对加样遗漏、模板质量、程序及引物适用性。

多条带或非特异产物：检查退火条件、引物设计及模板用量，按酶说明选择调整方式。

阴性对照出现产物：优先排查外源DNA、试剂及耗材污染，不能仅通过修改程序掩盖问题。[2]

模板编号____；引物编号____；酶与批号____；程序____；预期片段____；实际结果____；本轮调整____。

[1] NEB，Taq DNA Polymerase Guidelines for PCR Optimization。

[2] NEB，PCR Troubleshooting Guide。

原文中的反应参数适用于其注明的试剂条件，不应直接替代其他产品说明书。

资料核对日期：2026-09-12。